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冰冻体会

不同组织的冰冻切片体会

        冰冻切片原理：组织被冷冻时，组织中的水变成冰，而在这种状态中，组织变坚硬的。冰冻块的硬度可通过改变组织温度来改变。降温会使组织块更加坚硬，提高温度使组织变软。大多数非脂肪不固定组织的切片最好在-20到-25℃制作。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，多应用于手术中的快速病理诊断。

　　冰冻切片的制作过程中，常有许多因素影响其质量，并进一步影响结果的观察和分析，甚至会影响诊断，造成无法挽救的后果，对此我们经过比较及总结得出如下经验。

　　冰冻温度及组织冰冻的时间对冰冻切片质量的影响是至关重要的。

　　冰冻温度对细胞的影响：

　　温度太低，细胞容易收缩，温度太高，细胞容易膨胀，结构不清，模糊，影响冰冻诊断。充分利用冷冻台、冰锤及速冻头的功能。

　　将放有新鲜组织的冻托放在冻台上然后压上压板，等组织冻住后，轻敲压板，冻有组织的冻托就会下来，然后进行切片。

　　在实际工作中，一般冰冻机温度设定如下：

　　冻台温度：-18℃；

　　工作温度：-18℃；

　　冻头温度：-20℃。

　　（一）乳腺组织的冰冻切片

　　乳腺组织（纤维腺瘤，间质胶原化）含纤维组织较多，冰冻切片染色时容易脱片。

　　1、使用免疫组化防脱载玻片进行贴片，冰冻切片脱片率明显下降。

　　2、乳腺含脂肪组织比较丰富，在冰冻切片时不容易成片或展片。

　　3、乳腺组织在取材时，取材医生应尽量将病变周围的脂肪组织剔除。

　　4、当遇到脂肪组织较多，又无法剔除时，建议使用液氮。

　　5、充分利用冰冻切片机（速冻台）的功能。

　　（二）子宫肌瘤的冰冻切片

　　1、温度的控制：

　　冷冻温度是冰冻切片的关键；

　　冷冻室温度设定-17~-22度；

　　控制肌瘤组织冷冻时间，4/5组织冻好就可以；

　　冷冻过头时拿出冷冻室解冻软化一下。

　　2、包埋剂(OCT)的使用：

　　冻头中心滴好OCT粘好组织块，再在周围加固一圈；

　　虽然有可能加长了冷冻时间，但可以将组织牢牢固定住；

　　修片时不能太厚，要用慢进；

　　防止修片和切片时产生的抖动。

　　3、刀片和切片：

　　刀片的锋利程度会影响肌瘤的制片；

　　与常规石蜡切片一样，先用旧刀口粗修，再用新刀口摇片；

　　修片时只要组织完整就可以，因为越离冻头近组织块越硬；

　　修片要慢避免控制推头不稳造成组织擦板；

　　组织块进刀的方向减少阻力。

　　（三）脑组织冰冻切片

　　1、切片中的两大问题

　　（1）皱褶 冰晶

　　在制片过程中，很多因素均可影响冰冻制片质量和正确诊断，冰晶的形成就是主要因素之一。当冰晶溶解形成空泡时，会使细胞内结构移位而造成误诊。冰晶也可以引起细胞间针状裂隙，以及空泡挤压组织，导致组织正常结构改变。特别是冰晶小而多时，对组织结构损害更大，可以导致医生们无法及时地为临床提供准确的病理诊断依据。

　　（2）冰晶的形成

　　生物体是由细胞构成的，细胞中水分约占80%～90%，水在各种组织中含量最多。因为水在结冰时因氢键的交联而膨胀，所以待检的标本在冷冻过程中，水份很容易形成冰晶，使切片出现大量冰晶孔隙以及大小空泡，造成冷冻假象。在含水量较多的组织中更易发生。

　　2、冰晶产生的冷冻假象

　　一些含水量特别多的组织像脑组织、肾脏组织等冷冻时很容易产生冰晶。当组织中的水分凝固时形成球形的冰晶，挤压纤维组织条而产生泡沫样的形状，使切片出现大量冰晶孔隙以及大小空泡的冷冻假象。在有些冰冻切片中的细胞胞浆和细胞核里含有较多的空泡、空洞，也是冰晶造成的一种冷冻假象。

　　3、冰晶的生长速率对组织结构的影响

　　冰晶的大小与其生长速率成正比，而与形成速率（成核率）成反比，也就是冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响也愈严重。有文章认为冰冻开始时，冰晶形成速率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-3.3℃。从-3.0℃降至-4.3℃之间，形成速率急剧增加，然后再减慢。因此，在制片时首先必须做到组织在极短的时间内骤冷速冻，才能保证镜下观察时没有冰晶干扰，组织结构才能清晰，细胞形态才能完好。

　　4、怎样防止与减少冰晶形成？

　　怎样才能做到组织在极短的时间内骤冷速冻呢？基于上述理论，骤冷速冻的关键在于：取材的厚度、组织冷冻时的温度和时间、以及取材外部环境等。据此，可以采取以下措施，减少冰晶的形成。

　　5、防止与减少冰晶形成的方法：

　　（1）重视冰冻切片环节中的速冻

　　组织的厚度决定着速冻的时间，如果太厚，会导致标本的表面还没有冷冻，而贴近速冻台的一面温度已经太冷。在不影响病理诊断的前提下，标本取材尽量小一些，控制在1.5cm？l.5cm？0.3cm，厚度不超过4mm，这样有利于组织的快速冻结，并将组织块尽快移到冷冻头上骤冷，以缩短冷冻时间。

　　（2）提前开机做好预冷

　　避免由于缓慢冷冻而产生冰晶。临床科室若需术中冰冻，应先通知病理科，以便提前开机做好预冷。将冰冻切片机的温度降至－20℃～－25℃。一般将冷冻箱温度降至－25℃，冷冻头温度降至－30℃。

　　（3）保持刀具与台面的干燥

　　取材时尽量保持刀具与台面的干燥，避免组织与水接触，如送检组织内含水或血性液体，应用干的纱布或滤纸把水份吸干后再行冷冻。

　　（4）送检标本尽量避开水源

　　临床医师送检标本尽量避开水源不要用生理盐水浸泡或用湿纱布包裹组织，由于液体浸泡后，组织内水分会增加，容易造成冰冻后冰晶形成，建议将送检标本装入塑封袋送检。

　　（5）单纯OCT胶包埋法

　　将新鲜组织迅速置于包埋托上，再将组织的表面全部用进口OCT胶包被后放入低温切片机内冷冻切片，这样既可以提高冷冻速度，又可以避免接触空气后产生干、湿影响。

　　（6）冰冻切片厚度适中

　　冰冻切片不能太薄，一般≧6um，6um的片子可以有更多的空间避免风干假象，也会减少冰晶所造成的细胞核空洞。

　　“冰晶”是影响脑组织冰冻切片质量的罪魁祸首。如何避免或尽可能减少“冰晶”是我们急需解决的问题。

　　掌握“三度”是解决问题的关键：湿度、温度、速度

　　（四）含软骨组织冰冻切片

　　1、取材

　　取材厚度要适当，以3~5mm为宜，取材过厚，则冷冻时间需要延长，等到组织全层冻硬了，则表面的组织已经冻过头，过硬的表层组织切片易碎，或呈粉末状。如组织厚度过薄，在2mm以下则容易修片过度，造成组织完整性受损或切到组织冷冻托头。

　　2、包埋

　　组织在包埋时可在冻头上制作一个www.yihu.com.冻托，待冻托基本凝固时，将组织放在冻托上，再在组织周围放上www.yihu.com.后速冻。放置www.yihu.com.时要注意将其中的小气泡尽量去除，以免影响旁边组织产生挤压和褶皱。包埋在将组织完全埋入www.yihu.com.胶的基础上，还应在组织周围留有多余的www.yihu.com.，以利于牵引展开切片使用，否则出刀、入刀处会有褶皱影响制片效果。

　　3、温度和时间

　　气管切缘等软骨类组织的冰冻切片机温度一般设定在-22℃左右，温度过高造成组织偏软，容易产生搓板状、梯田状、厚薄不均，温度过低则硬度过硬，使得组织容易破碎或产生粉末状现象。冰冻时间一般以组织刚刚发白即进行修片为宜，以免冷冻时间过长造成组织温度过低，发硬、难以切片。当修片时发现冷冻过头时可以用指腹贴近组织3~5s，使组织迅速升温到适宜的温度，并且观察组织切面变化掌握适宜时机，切出完整切片。

　　4、切片

　　首先要做好准备工作，如刀要锋利，若用一次性切片刀，要根据情况，做到及时的更换刀片。检查刀架，锁牢各关节，防止切片时“跳片”等情况出现。调整刀架角度、刀片也应在刀架上冻置一段时间后再切，因为新换上的刀片由于温度较高也可能会造成切片粘连。切片时用力要均匀、柔和。切片机配有防卷板时应注意抗卷板与刀锋距离，如不带有防卷板或不习惯使用时要注意牵引展开切片的力度，既要防止力度过小时出现的褶皱，也要避免用力过大造成的组织破裂。附贴切片时动作也需轻巧、快速、用力需均匀，防止切好的组织卷曲出现褶皱。

　　5、固定

　　切完组织切片应立刻放入固定液中，防止切片干后再固定造成的细胞核染色质的不清晰。固定时间以30s左右为宜，既使得组织得到充分固定，亦防止由于固定浸泡时间过长造成组织脱片。同时需要指出的是浓度过低的固定液有时也可能是组织脱片的原因之一。

　　结论：冰冻切片是较难掌握的病理技术之一，要制作出一张优质的冰冻切片，医生和技术员都必须加强责任心。做到冰冻制片的每一个环节都精益求精，并且不断总结经验和教训，逐步提高切片质量，缩小与常规石蜡切片的差距，减少冰冻切片的人为假象，才能为正确的病理诊断提供有力保障，才能更好地服务于临床，切实做到对患者负责。